细菌已经进化出特殊的防御机制来抵御病毒的侵袭 ，而这些病毒不但仅熏染人类。在所谓的CRISPR-Cas系统中 ，CRISPR核糖核酸（crRNA） ，作为“向导RNA” ，能够识别外源基因组 ，如病毒DNA的特定区域。由crRNA指引的CRISPR相关（Cas）核酸酶随后像铰剪一样切割这些区域 ，从而将其无害化。
人类已经使用了这种机制：“CRISPR经常被称作‘基因铰剪’ ，它是许多分子手艺的基础 ，”海尔姆霍兹RNA熏染研究所合成生物学部分主任蔡斯·贝塞尔说。该所是位于维尔茨堡的布劳恩施魏格海尔姆霍兹熏染研究中心与维尔茨堡朱利叶斯-马克西米利安大学相助的研究机构 ，贝塞尔在该校担当教授。
贝塞尔的实验室与JMU相助 ，在2021年开发了名为LEOPARD的诊断平台 ，同样接纳了CRISPR手艺。LEOPARD可以在一次检测中识别多种与疾病相关的生物标记物。该要领基于对所谓的tracrRNAs（转录激活CRISPR RNA）的重新编程 ，这些RNA在自然状态下资助天生Cas9和种种Cas12核酸酶使用的向导RNA。“LEOPARD主要关注Cas9。然而 ，CRISPR-Cas系统还包括另一种多样化的核酸酶群 ，称为Cas12 ，”贝塞尔诠释道。只管Cas9和Cas12都能切割DNA目的 ，但Cas12能通过切割其他“附加”DNA来增强信号输出。这使得检测手艺越发敏感 ，从而越发有用。
贝塞尔向导的团队最近将LEOPARD的奇异功效扩展到了Cas12。研究职员将这一新要领命名为PUMA（可编程tracrRNAs释放Cas12核酸酶自力于原位点相邻念头的核糖核酸检测）。他们的研究效果已在《自然通讯》杂志上揭晓。
只管Cas12核酸酶已被普遍应用于分子诊断 ，但其主要限制在于只能针对DNA目的 ，并且需要一个特定的识别序列 ，即原位点相邻念头（PAM） ，以识别目的分子。
PUMA巧妙地解决了这些挑战。与LEOPARD一样 ，这种新要领也依赖于tracrRNAs。“通过使用PUMA ，我们可以重新编程tracrRNAs ，从而选择哪个RNA生物标记转化为向导RNA。这个向导RNA随后指导Cas12抵达我们提供的DNA分子 ，并激活基因铰剪 ，”研究的第一作者乔春雷诠释道。乔春雷曾是贝塞尔实验室的研究生和博士后研究员 ，他最近在新加坡国立大学获得了教职。“DNA的切割反响告诉我们样本中保存哪些生物标记 ，好比特定病原体的生物标记 ，”贝塞尔增补说。
图片信息：使用新的PUMA手艺 ，基因铰剪可以很容易地检测RNA。
这种新要领使得使用CRISPR核酸酶检测通常只能识别DNA的RNA生物标记成为可能。“这关于那些仅在RNA水平上保存的分子生物标记尤其主要 ，例如RNA病毒 ，”贝塞尔说。别的 ，PUMA无需特定的识别序列：PAM已包括在我们提供的DNA目的分子中。由于研究者提供目的分子 ，他们还能引入截短的DNA ，从而显著提高了该要领的速率。
“PUMA具备成为RNA检测领域中无邪且准确工具的潜力 ，”贝塞尔总结道。最终 ，该团队通过识别与急性败血症相关的五种细菌病原体 ，展示了该要领的潜力。他们的检测依赖于一个通用、重新编程的tracrRNA ，为区分差别类型的细菌提供了一种简化的要领。这为医学中的普遍应用开发了蹊径：“这项新手艺代表了CRISPR诊断的一种新形式 ，能够在临床点实现可靠的分子检测 ，无论是用于识别病毒照旧细菌病原体 ，或是检测癌症生物标记 ，”乔春雷说。
研究团队已经最先妄想下一步行动：“sunbet目的是实现与LEOPARD类似的多路复用读出 ，并扩大这项手艺的应用规模 ，”贝塞尔体现 ，他还预期这项手艺将在研究社区中被普遍使用：“我们希望sunbet研究能进一步推动tracrRNA重新编程的探索。”
杂志：Nature Communications
DOI：10.1038/s41467-024-50243-x
